בן ארבעים ואחת, ב-5 לדצמבר 1963 התמנה רבין לרמטכ"ל השביעי של צה"ל. תקופת כהונתו עמדה בסימן התעצמות מצרים וסוריה בנשק סובייטי מתקדם, ניסיונות הסורים להטות את מקורות המים של ישראל ותמיכתה של סוריה ומדינות נוספות בפעילות טרור. במאי 1967 כשנודע שמצרים מזרימה כוחות ובהם כוחות שריון לחצי האי סיני, החליט רב אלוף יצחק רבין על גיוס מילואים נרחב. בכלי התקשורת הערביים נשמעו דברי שיטנה ורהב על השמדתה הקרובה של ישראל. סוריה וירדן התייצבו לימין גמאל עבד אל נאצר, נשיא מצרים שחסם את מצרי טיראן לשיט ישראלי.
בקרב האזרחים בישראל שררה דאגה ואפילו חרדה קיומית. הקמת ממשלת אחדות לאומית ומינוי של משה דיין לשר ביטחון הביאו לעליית המורל. הממשלה התקשתה לקבל החלטה לצאת למלחמה. הרמטכ"ל רבין ורבים ממפקדי צה"ל תמכו ביציאה למלחמת-מכת מנע אולם ראש הממשלה לוי אשכול וחלק גדול משריו היססו וביקשו להמתין לתוצאות המגעים הדיפלומטיים ליישב המשבר. תקופה זו כונתה כידוע "תקופת ההמתנה".
בתום ההמתנה, לאחר שהמאמצים הדיפלומטיים לישוב המשבר כשלו, פתחה ישראל בבוקרו של ה-5 ליוני 1967 במכת מנע יזומה, "מבצע מוקד" שבו הושמד חיל-האוויר המצרי. ישראל זכתה ביתרון ראשוני אדיר, והחלה מלחמת ששת הימים שנמשכה כשמה שישה ימים והסתיימה בניצחון מזהיר ומרשים של צה"ל. במהלך המלחמה כבשה מדינת ישראל שטחים נרחבים בסיני, את רצועת עזה, רמת הגולן, יהודה ושומרון ומזרח ירושלים. השטח הכולל שנכבש גדול פי שלושה משטחה של מדינת ישראל לפני המלחמה.
לאות הוקרה על הניצחון במלחמת ששת הימים העניקה האוניברסיטה העברית לרבין תואר דוקטור לשם כבוד. בטקס קבלת התואר, שנערך ב-28 ביוני 1967 על הר הצופים, נשא רבין את "נאום הר הצופים", שביטא את רוח צה"ל, וזכה להד רב ונכנס לדפי ההיסטוריה.